27 đội bóng có 22 đội bóng tham dự từ vòng 1/16 và 5 đội (Hà Nội ACB, Thể Công, GM Mikado Nam Định, Khatoco Khánh Hòa và Becamex Bình Dương) được miễn vòng đấu này, vào thẳng vòng 1/8.[1]

Giải áp dụng luật thi đấu của FIFA, và các quy chế, quy định của Liên đoàn bóng đá Việt Nam.

Thể thức thi đấu loại trực tiếp 1 trận và không đá hiệp phụ nếu hoà sau 2 hiệp chính mà đá luân lưu 11 mét ngay để xác định đội thắng. Hai đội thua ở bán kết cùng xếp thứ ba. Đội đoạt Cúp (vô địch) sẽ dự trận tranh Siêu cúp Việt Nam và đại diện Việt Nam tham dự AFC Cup năm 2010.

Ở vòng 1/16, mỗi đội được đăng ký tối đa 30 cầu thủ (với tối đa 3 cầu thủ nước ngoài). Nếu như đội bóng chưa đăng ký đủ 30 cầu thủ ở vòng 1/16 sẽ được bổ sung tối đa là 5 cầu thủ ở vòng 1/8.[3]